使用傳統的光學顯微鏡，光的衍射將成像分辨率限制在約250納米。在下面提到的一種方法中，超分辨率技術有時可以將其提高10倍或更多。今天，這項技術涉及多種方法，但主要有三種：單分子定位顯微鏡，包括光活化定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）; 結構照明顯微鏡（SIM），雖然一些專家指出，SIM的分辨率只能與良好的共聚焦顯微鏡相媲美; 和受激發射損耗顯微鏡（STED）。

“不幸的是，決定采用哪種超分辨率方法并沒有簡單的規則，”英國牛津大學的Henry Wellcome博士后，Mathew Stracy說。“每個人都有自己的優點和缺點。”

科學家們使用各種技術為特定項目選擇正確的方法。“找到解決問題的**簡單的解決方案，”海法以色列理工學院TEChnion生物醫學工程助理教授Yoav ShEChtman說。“在生物成像環境中，關鍵考慮因素包括：所需的空間和時間分辨率，對光損傷的敏感性，標記能力，樣品厚度 - 這是2D還是3D問題？ - 背景熒光水平，或細胞自發熒光。”

超級資源的ABCs

超分辨率顯微鏡的形式以不同的方式工作。例如，對于PALM和STORM，在任何給定時刻，只有一小部分分子上的熒光標記被打開或光活化，從而允許它們以高精度獨立定位。對所有熒光標記執行此過程可構建完整的超分辨圖像。“PALM / STORM系統相對容易構建，但更難以應用，因為熒光團必須是可光活化的，”馬克斯普朗克生物物理化學研究所主任，2014年諾貝爾化學獎獲得者之一Stefan Hell說。用于超分辨率成像。“他們的局限在于他們需要在細胞背景中檢測單個熒光分子。”他補充說，這些技術“使用的可靠性不如STED”。

使用SIM，光的干涉圖案在成像期間在樣品上產生網格。基于傅里葉變換的圖像和算法之間的網格轉換使用結果信息來定位特征。

STED使用激光脈沖打開熒光團，另一個打開熒光團。在樣本上掃描焦點以生成圖像。“STED的優勢在于它是一種按鍵技術，”Hell解釋道。“它幾乎可以像標準的共聚焦熒光顯微鏡一樣使用。”它還能用一些熒光團成像活細胞，如綠色或黃色熒光蛋白和硅羅丹明衍生染料。

埃默里大學的助理科學家尼爾&midDOt;安東尼在考慮使用哪種超級分辨率時說，“這一切都必須逐案考慮。”他指出，PALM和STORM“對活細胞不太好” ，“但STED可用于活細胞或固定細胞。

評估參數

盡管所有超分辨率技術都超過了傳統光學顯微鏡的分辨率，但有些技術比其他技術獲得了更多的收益。SIM大致將分辨率提高一倍，降**約100納米。PALM和STORM可以解析大約15納米的特征。地獄表示，STED“可以在活細胞中提供低**30納米的空間分辨率，在固定細胞中提供15納米的空間分辨率。”

在評估具體應用時，還必須考慮單噪比。在某些情況下，較低的分辨率但較高的單噪比會產生比更好的分辨率更好的圖像，但會降低單一噪聲比。

獲取圖像的速度在某些應用中很重要，尤其是具有活細胞的應用。“所有的超分辨率技術都比傳統的熒光成像慢，”Stracy說。“PALM / STORM是**慢的，需要數萬幀才能獲得單個圖像，SIM每張圖像需要數十幀，而STED是一種掃描技術，因此采集速度取決于視場的大小。”

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除了成像活細胞或固定細胞外，一些科學家還想知道事物是如何移動的。例如，Stracy“對觀察活細胞中生物系統的動態感興趣，而不僅僅是靜態圖像，人們通常將其與顯微鏡聯系起來。”他可以用PALM結合活細胞中的單粒子跟蹤來分析動力學。通過這種方式，Stracy說他可以“直接跟蹤標記分子，因為它們在細胞中發揮作用。”STED加熒光相關光譜也可用于觀察標記分子在STED成像體積中移動。“另一方面，SIM不適合研究這些分子水平的動態過程，但由于它的獲取速度相對較快，因此非常適合觀察細胞中較大結構的動態，例如整個染色體，幾分鐘后，“他說。

一到一個

2017年，Hell的團隊報道了MINFLUX超分辨率顯微鏡。1 “這種超分辨率方法通常在真正的分子尺度上實現了**次空間分辨率，1納米，”Hell說。“此外，它允許跟蹤活細胞中的單個分子，其速度**少比以前任何其他方法高100倍。”

MINFLUX-具有1納米的分辨率 - 清楚地分辨出八個彼此分開約11納米的不同分子。（圖片由Francisco Balzarotti，Yvan Eilers，Klaus Gwosch，ArvidGynnå，Volker WestpHal，FernanDO Stefani，Johan Elf和Stefan Hell提供。）

其他科學家也宣稱了MINFLUX超分辨率顯微鏡的價值。根據ShEChtman的說法，“新的應用程序和方法開發不斷涌現，但我想到了兩個令人興奮的進展。”他說，其中一個是MINFLUX。他說，在描述它的好處時，“利用一種巧妙的方法，以極高的精度和非常有限的光子預算獲得分子定位。”

作為第二個令人興奮的近期進展，Shechtman指出，WE Moerner--也是2014年諾貝爾化學獎的超分辨率成像獲獎者之一 - 以及他的斯坦福大學同事改進了成像分辨率，這可能受到各向異性發射的限制。熒光單分子。為了解決這個問題，Shechtman說，Moerner實驗室的科學家們通過使用不同的激發極化來測量分子的取向及其位置?；蛘撸麄冮_發了復雜的光瞳平面工程，完全消除了方向誘導的定位偏差。“ 2-4這些技術提高了定位結構的能力。

看著標簽

在許多超分辨率應用中，標簽確實有所不同，并且存在一些商業選擇。例如，總部位于德國的Miltenyi Biotec與Stefan Hell聯合創辦的初創公司Abberior合作，為超分辨率顯微鏡染料提供定制抗體結合服務。

在許多超分辨率應用中，標簽確實有所不同，并且存在一些商業選擇。

其他公司也提供適用于超分辨率顯微鏡的標簽。例如，ChromoTek營銷部門的ChristopH Eckert說：“我們的Nano-Boosters非常小 - 大約15千道爾頓 - 并且具有高度特異性。”這些蛋白質與綠色和紅色熒光蛋白（分別為GFP和RFP）和波形蛋白結合。結合蛋白。“結合蛋白來源于單域羊駝抗體片段，稱為V H Hs或納米體，”Eckert解釋說。“這些V H Hs結構域非常小，具有優異的結合特性，并且可以在不進行批次間變化的情況下以恒定的高質量生產。”

這些標簽的大小在超分辨率顯微鏡中有所不同。與熒光染料相結合，V H Hs是超分辨率的有用工具。正如?？颂刂赋龅哪菢?，“小于2納米的表位 - 標記位移可以**大限度地減少連鎖誤差。”他補充說，“傳統檢測系統的熒光團距離更遠，通常為15-30納米。”這些標簽適用于一系列超級分辨率技術，包括SIM，PALM，STORM和STED。

馬里蘭大學醫學院助理教授唐愛慧及其同事使用ChromoTek的GFP-Booster和STORM來探索神經系統的信息傳遞。5在突觸 - 神經元交流的地方 - 作者在突觸前和突觸后神經元中發現了分子的納米團簇，這些分子形成了他們所描述的納米柱?？茖W家得出結論：“這種結構提示了中樞神經系統突觸的簡單組織原理，以維持和調節突觸效率。”

超分辨率成像的版本和越來越多的方法將繼續為科學家提供更接近生物學的觀點。在某些情況下，生物學家甚**可以觀察細胞的作用 - 同時打破可見光的衍射極限。

參考

1 Balzarotti，F，et al。“具有**小光子通量的熒光分子的納米分辨率成像和跟蹤”，Science 355：606-612,2017。[PMID：28008086 ]

2 Backer，AS，et al。“使用超分辨率顯微鏡和同時單分子定向測量增強DNA成像，”Optica 3：3-6,2016。[PMID：27722186 ]

3 Backlund，MP，et al。“使用寬帶超曲面掩模去除單分子顯微鏡中取向誘導的定位偏差”，Nature pHotonics 10：459-462,2016。[PMID：27574529 ]

4 Lew，MD，Moerner，WE。“方位角偏振濾波，用于精確，精確，穩定的單分子定位顯微鏡。”Nano Letters 14：6407-6413,2014。[PMID：25272093 ]

5 Tang，AH，et al。“跨突觸納米柱將神經遞質釋放與受體結合，”Nature 536：210-214,2016。[PMID：27462810 ]